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npj Science of Food volumen 7, Número de artículo: 21 (2023) Citar este artículo

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Los productos probióticos funcionales han llamado mucho la atención debido a su creciente popularidad. Sin embargo, pocos estudios han analizado el metabolismo específico de los probióticos en el proceso de fermentación. Este estudio aplicó metabolómica basada en UPLC-QE-MS para rastrear cambios en los metabolomas de la leche en el curso de la fermentación por dos cepas probióticas, Lacticaseibacillus paracasei PC-01 y Bifidobacterium teenageris B8589. Observamos cambios sustanciales en el metaboloma de la leche fermentada probiótica entre las 0 y las 36 h de fermentación, y las diferencias entre los metabolomas de la leche en el período intermedio (36 h y 60 h) y la etapa de maduración (60 h y 72 h) fueron menos obvias. . Se identificaron varios metabolitos diferenciales específicos de puntos temporales, principalmente pertenecientes a ácidos orgánicos, aminoácidos y ácidos grasos. Nueve de los metabolitos diferenciales identificados están relacionados con el ciclo del ácido tricarboxílico, el metabolismo del glutamato y el metabolismo de los ácidos grasos. Los contenidos de ácido pirúvico, ácido γ-aminobutírico y ácido cáprico aumentaron al final de la fermentación, lo que puede contribuir a la calidad nutricional y las propiedades funcionales de la leche fermentada probiótica. Este estudio de metabolómica a lo largo del tiempo analizó los cambios fermentativos específicos de los probióticos en la leche, proporcionando información detallada del metabolismo de los probióticos en una matriz de leche y el posible mecanismo beneficioso de la leche fermentada con probióticos.

La fermentación es un proceso metabólico, en el cual las materias orgánicas se descomponen completamente bajo la acción de enzimas1. La leche fermentada es uno de los alimentos fermentados más importantes, reconocido como un alimento saludable y un buen portador de probióticos2. Los probióticos se distribuyen ampliamente en el tracto intestinal, la cavidad oral, el tracto reproductivo femenino e incluso en la capa mucosa de la piel. La intervención de probióticos en la leche fermentada cuenta con el respaldo de los médicos, especialmente los gastroenterólogos de todo el mundo3. Cada vez hay más pruebas de que la leche fermentada probiótica confiere varios beneficios para la salud a los consumidores, como la reducción del colesterol sérico, el aumento de las respuestas inmunitarias, la mejora de la salud intestinal, la prevención de varios tipos de cáncer y la mitigación del deterioro cognitivo2. Estos efectos pueden atribuirse a varios componentes funcionales en la leche fermentada probiótica, como péptidos, polisacáridos, ácidos grasos, ácidos orgánicos, vitaminas y ácido γ-aminobutírico (GABA)4. Lacticaseibacillus paracasei se ha utilizado ampliamente en la industria alimentaria probiótica debido a sus efectos sobre la salud. Las declaraciones de propiedades saludables no se limitan a la salud gastrointestinal, sino también a la inmunidad del huésped, y la evidencia científica reciente respalda su eficacia clínica en el alivio de enfermedades bucales, como la periodontitis y la caries dental5,6. Más importante aún, algunas cepas de Lacticaseibacillus paracasei tienen buenas características de fermentación y pueden usarse en la fermentación de alimentos6,7. Otro grupo de bacterias beneficiosas son las bifidobacterias. La especie Bifidobacterium adolescencia ha llamado cada vez más la atención porque es un componente importante de la microbiota intestinal humana que se relaciona con la salud del huésped, como mantener un peso corporal saludable8 y prevenir el estreñimiento9. Sin embargo, Bifidobacterium adolescenciais es difícil de usar para la fermentación debido a su baja viabilidad10. Por lo tanto, la fermentación compuesta de Bifidobacterium adolescencia con otras cepas con buen rendimiento fermentativo sería una opción que aumentaría su viabilidad como probiótico.

Algunos estudios previos han investigado los cambios en los metabolomas de la leche fermentada con probióticos, pero la mayoría de los estudios no se centran en analizar la función y el metabolismo específicos de los probióticos en el proceso1,11. Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus son las bacterias iniciadoras básicas más comunes utilizadas en combinación con probióticos para producir fermentación de leche probiótica10. Sin embargo, el uso combinado de estas bacterias iniciadoras tradicionales con probióticos en la fermentación hace que sea difícil distinguir los efectos bioquímicos y el metabolismo específicos de los probióticos de los de las bacterias iniciadoras tradicionales. Por lo tanto, sería interesante investigar el efecto único de los probióticos en el metaboloma de la leche, lo que proporcionaría información sobre el metabolismo específico de los probióticos. Además, los cambios de maduración en el metaboloma de la leche de los productos probióticos pueden ocurrir debido a la acción fisiológica continua de microbios viables incluso después de que finaliza la fermentación. Esto es de particular importancia en los productos probióticos, ya que la alta viabilidad de las bacterias probióticas durante y después de la fermentación es crucial para sus efectos beneficiosos. Sin embargo, estudios previos generalmente solo analizan los cambios de maduración sin enfocarse en monitorear los cambios de metabolitos durante el proceso de fermentación de la leche, lo que también reflejaría la calidad y estabilidad del producto11,12.

Este estudio aplicó dos cepas probióticas en la fermentación de la leche, a saber, Lacticaseibacillus paracasei PC-01 (PC-01) y Bifidobacterium adolescenciais B8589 (B8589). La cepa PC-01 se aisló de leche de yak fermentada naturalmente. Por sus buenas características fermentativas y probióticas, se ha aplicado con éxito en la producción de leche fermentada13. La cepa B8589 se aisló del intestino de un bebé sano; y tiene buenos efectos antiinflamatorios y reguladores de la microbiota intestinal14. Además, nuestro estudio anterior encontró que el uso combinado de PC-01 y B8589 en la fermentación de la leche aumentó significativamente los niveles de GABA y ácidos grasos de cadena corta en la leche fermentada producida en comparación con el uso de la cepa PC-01 sola, lo que probablemente mejora su función probiótica13. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar más a fondo los cambios metabolómicos de la leche durante los procesos de co-fermentación y maduración de la leche fermentada cuando ambas cepas se usaron juntas como iniciador lácteo. Los cambios en los recuentos viables y la metabolómica de la leche se monitorearon mediante citómetro de flujo y metabolómica no dirigida, respectivamente (Fig. 1).

La leche pasteurizada fue co-fermentada por dos cepas probióticas, Bifidobacterium adolescenciais B8589 y Lacticaseibacillus paracasei PC-01. Se recolectaron muestras cada 12 h de fermentación hasta que el pH alcanzó 3.8 después de 72 h. El recuento viable de probióticos en la leche fermentada se enumeró mediante citometría de flujo. Los metabolomas de la leche (a las 0, 36, 60 y 72 h) se detectaron mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento para rastrear los cambios en los metabolitos y las vías metabólicas de interés en el curso de la fermentación de la leche. Finalmente, se realizó un análisis de enriquecimiento en las vías metabólicas diferenciales identificadas.

El recuento de células viables de la leche fermentada probiótica se detectó en diferentes momentos de la fermentación mediante citometría de flujo (Fig. 2A). El recuento de células viables alcanzó un pico a las 36 h de fermentación (1,57 × 1010 CFU/mL), que fue significativamente mayor que a las 0 h (8,49 × 107 CFU/mL; P < 0,001). Disminuyó significativamente a 8,87 × 109 CFU/mL a las 60 h (P < 0,001) y aumentó a 1,57 × 1010 CFU/mL a las 72 h (P < 0,001).

A Cambios en el conteo de células viables en la leche fermentada probiótica. Las barras de error representan la media ± SD. *** P < 0,001. Las diferencias en los recuentos microbianos viables entre puntos temporales se evaluaron mediante ANOVA al nivel de significación del 95 % (P < 0,05). B Gráfica de puntuación del análisis de componentes principales de los metabolomas de la leche en diferentes puntos de tiempo, es decir, 0, 36, 60 y 72 h de fermentación. Muestras de control de calidad de control de calidad.

Se realizó una metabolómica no dirigida (basada en UPLC-QE-MS) en las muestras de leche fermentada probiótica recolectadas a las 0, 36, 60 y 72 h. Para mejorar la interpretabilidad y validar nuestros datos, se realizaron análisis de componentes principales y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) para visualizar cambios en el metaboloma de la leche en diferentes momentos. El análisis de componentes principales es un algoritmo de aprendizaje automático no supervisado que refleja la variabilidad general entre muestras. Los ejes x e y, respectivamente, muestran las puntuaciones proyectadas de las muestras en el plano compuesto por los componentes principales primero y segundo, que pueden proporcionar una referencia para la similitud o diferencia entre las muestras. Los símbolos que representan muestras de 0, 36, 60 y 72 h mostraron una tendencia distinta de agrupamiento basada en el tiempo, y las muestras de control de calidad también se agruparon estrechamente como un grupo (Fig. 2B), lo que sugiere que la estructura general del metaboloma de la leche varió entre el tiempo. puntos, y que el equipo y las condiciones cromatográficas eran estables y fiables.

Luego, se usaron modelos OPLS-DA para identificar metabolitos marcadores diferenciales entre puntos de tiempo (0 h versus 36 h; 36 h versus 60 h; 60 h versus 72 h). El modelo OPLS-DA se basa en la clasificación supervisada. Filtra las variables ortogonales que no están relacionadas con las variables categóricas de los metabolitos y analiza las variables no ortogonales y ortogonales por separado, para obtener metabolitos diferenciales más fiables entre grupos. Los gráficos de puntuación de los modelos OPLS-DA se muestran en la Fig. 3A-C. Nuevamente, se observa una clara tendencia de agrupamiento basada en el tiempo en cada comparación por pares. Además, los parámetros del modelo para cada grupo confirmaron la validez y precisión de los modelos (0 h versus 36 h: R2Y = 0,999, Q2 = 0,997; 36 h versus 60 h: R2Y = 0,992, Q2 = 0,983; 60 h versus 72 h: R2Y = 0,994, Q2 = 0,988).

Gráficos de puntuación de análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales A–C y gráficos de volcanes D–F de muestras de leche fermentada. A, D 0 h versus 36 h; B, E 36 h versus 60 h; C, F 60 h versus 72 h. Los gráficos de volcanes ilustran los datos de metabolómica de la leche. Cada punto representa un metabolito detectado. Los metabolitos significativamente aumentados (Sig_Up) y disminuidos (Sig_Down) encontrados mediante la comparación por pares entre muestras se muestran en rojo y azul, respectivamente (punto de corte P < 0,05 y cambio de pliegue [FC] >2 o <0,5). Los umbrales significativos están marcados por las líneas de puntos negros en los gráficos de volcanes. Los metabolitos diferenciales entre los puntos de tiempo se evaluaron mediante ANOVA al nivel de significancia del 95 % (P < 0,05).

Los metabolitos detectados se visualizan en gráficos de volcanes (Fig. 3D-F), y los umbrales de corte para los metabolitos de marcadores diferenciales fueron un cambio de veces ˃2 o <0.05 y P <0.05. Se identificaron un total de 304 metabolitos diferenciales (151 aumentados y 153 disminuidos a las 36 h en comparación con las 0 h), 244 de los cuales fueron identificados mediante búsquedas en bases de datos (Tabla complementaria 1), incluidos 66 lípidos y moléculas similares a lípidos, 59 ácidos orgánicos y derivados, 43 compuestos orgánicos de oxígeno, 31 compuestos heterocíclicos de órganos, 13 fenilpropanoides y policétidos, 15 bencenoides y otros diecisiete metabolitos. Se identificaron ciento diez metabolitos diferenciales entre los metabolomas de la leche probiótica a las 36 y 60 h (43 aumentaron y 67 disminuyeron a las 60 h en comparación con las 36 h), y 79 de estos metabolitos diferenciales se identificaron mediante búsquedas en bases de datos (Tabla complementaria 1), incluidos 21 compuestos orgánicos de oxígeno, 20 ácidos orgánicos y derivados, 17 compuestos heterocíclicos de órganos, nueve lípidos y moléculas similares a lípidos y otros 12 metabolitos. Treinta y seis metabolitos diferenciales se identificaron entre las 60 h y las 72 h (24 aumentaron y 12 disminuyeron a las 72 h en comparación con las 60 h), y 27 de estos metabolitos diferenciales se identificaron mediante búsquedas en bases de datos (Tabla complementaria 1), incluidos siete lípidos y lípidos. -como moléculas, nueve compuestos orgánicos de oxígeno, cinco ácidos orgánicos y derivados, y otros seis metabolitos.

Luego, clasificamos los metabolitos diferenciales clave por naturaleza química para obtener una mayor comprensión del proceso bioquímico en la producción de leche fermentada probiótica (Fig. 4). Los cuatro tipos principales de metabolitos diferenciales pertenecían a lípidos y moléculas similares a lípidos, ácidos orgánicos y derivados, compuestos orgánicos de oxígeno y compuestos heterocíclicos de órganos, seguidos de fenilpropanoides y policétidos, bencenoides, alcaloides y derivados, etc. Obviamente, se encontraron diferentes perfiles metabólicos diferenciales (tanto en diversidad como en abundancia de metabolitos) entre puntos de tiempo (0 h versus 36 h; 36 h versus 60 h; y 60 h versus 72 h). Para investigar más a fondo los cambios bioquímicos en diferentes etapas de la fermentación de la leche, realizamos selectivamente un análisis de enriquecimiento de la vía metabólica en tres tipos principales de metabolitos (es decir, lípidos y moléculas similares a lípidos, ácidos orgánicos y sus derivados, compuestos orgánicos de oxígeno).

Las barras horizontales de color rosa, verde y azul representan el número de metabolitos diferenciales (escritos junto a/en las barras) identificados entre las 0 h y las 36 h; 36h y 60h; 60 h y 72 h, respectivamente.

El análisis de enriquecimiento de rutas de metabolitos es una herramienta eficaz para dilucidar los mecanismos de las alteraciones metabólicas de las muestras. De 0 a 36 h, se identificaron 25 vías metabólicas relacionadas con ácidos orgánicos y derivados, que involucran 17 metabolitos diferentes (principalmente aminoácidos y ácidos orgánicos; Fig. 5A y Tabla complementaria 2). Se enriquecieron diez lípidos y vías metabólicas relacionadas con moléculas similares a lípidos, que involucran nueve metabolitos diferentes (principalmente ácidos grasos y glicerofosfolípidos; Fig. 5B y Tabla complementaria 2). Se identificaron diez vías metabólicas relacionadas con compuestos orgánicos de oxígeno, que involucran 13 metabolitos diferentes (principalmente carbohidratos; Fig. 5C y Tabla complementaria 2).

Comparación entre (A–C) 0 h y 36 h; D–V 36 h y 60 h; y G-I 60 h y 72 h. Las rutas enriquecidas están relacionadas con ácidos orgánicos y derivados (A, D, G), lípidos y moléculas similares a lípidos (B, E, H) y compuestos orgánicos de oxígeno (C, F, I), respectivamente. La escala de colores representa la confianza de la diferencia significativa (valor P) entre pares de muestras. Las vías metabólicas diferenciales se detectaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.

De 36 a 60 h, se identificaron 17 vías metabólicas relacionadas con ácidos orgánicos y derivados, que involucran 6 diferentes (principalmente aminoácidos y ácidos orgánicos; Fig. 5D y Tabla complementaria 2). Se enriquecieron tres vías metabólicas relacionadas con lípidos y moléculas similares a lípidos, que involucran dos metabolitos de glicerofosfolípidos diferentes (Fig. 5E y Tabla complementaria 2). Se identificaron siete vías metabólicas relacionadas con compuestos orgánicos de oxígeno, que involucran siete metabolitos diferentes (principalmente carbohidratos; Fig. 5F y Tabla complementaria 2).

De 60 a 72 h, se identificaron dos vías metabólicas relacionadas con ácidos orgánicos y derivados, que involucran un ácido orgánico (Fig. 5G y Tabla complementaria 2). Se enriquecieron dos vías metabólicas relacionadas con lípidos y moléculas similares a lípidos, que involucran dos metabolitos diferentes (principalmente ácidos grasos y ácidos biliares; Fig. 5H y Tabla complementaria 2). Se identificaron seis vías metabólicas relacionadas con compuestos orgánicos de oxígeno, que involucran cinco metabolitos diferentes (principalmente azúcares, compuestos carbonílicos y alcoholes; Fig. 5I y Tabla complementaria 2).

Este estudio utilizó metabolómica basada en LC-MS para investigar los cambios metabólicos en el metaboloma de la leche probiótica en diferentes momentos durante la fermentación compleja por las cepas bacterianas, PC-01 y B8589. Mediante la comparación de metabolitos en diferentes momentos, se han identificado algunos biomarcadores diferenciales significativos. Estos metabolitos son principalmente ácidos orgánicos, aminoácidos y ácidos grasos, que están involucrados en importantes vías metabólicas como el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), el metabolismo de los ácidos grasos y el metabolismo del glutamato (Fig. 6). Estos metabolitos y las vías metabólicas en las que participan no solo afectan el crecimiento y la reproducción de las bacterias probióticas en el entorno de la leche, sino que también influyen en el sabor y las propiedades probióticas de la leche fermentada. Las vías metabólicas son complejas y cada vía puede promoverse o inhibirse entre sí mediante un mecanismo de retroalimentación de los metabolitos producidos. Hasta donde sabemos, las interacciones de algunos de los metabolitos encontrados actualmente y sus vías metabólicas asociadas/efectos específicos en la fermentación de la leche no se han informado previamente, lo que amerita una mayor investigación. Nueve metabolitos específicos de la etapa de fermentación (ácido succínico, ácido pirúvico, ácido l-glutámico, ácido fumárico, GABA, ácido cáprico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico) contribuyeron significativamente al metabolismo diferencialmente enriquecido (Fig. 6). Estos metabolitos son ubicuos en la leche fermentada y son importantes por su calidad y propiedades sensoriales.

Los nueve metabolitos (a saber, ácido pirúvico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido l-glutámico, GABA, ácido palmítico, ácido oleico, ácido esteárico y ácido cáprico) están escritos en negro en el mapa metabólico (panel izquierdo). El gráfico de barras horizontales (panel derecho) muestra que la abundancia relativa de estos metabolitos en diferentes momentos de recolección de muestras, es decir, 0, 36, 60 y 72 h. CoA coenzima A, ácido GABA γ-aminobutírico, ácido tricarboxílico TCA.

La mayoría de los metabolitos diferenciales son ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos más comunes son los ácidos carboxílicos (R-COOH), y su acidez proviene del grupo carboxilo (−COOH). Los ácidos carboxílicos de cadena corta son factores químicos importantes que afectan el sabor de los productos lácteos. Estos ácidos se originan de la lipólisis, del metabolismo de los carbohidratos y del metabolismo de los aminoácidos15. Los biomarcadores de ácidos carboxílicos de cadena corta encontrados en este estudio incluyen ácido succínico, ácido pirúvico y ácido fumárico, que se generan en el metabolismo de las bacterias del ácido láctico7,16,17.

El piruvato se forma al descomponer la glucosa 6-fosfato formada después de la fosforilación de la glucosa por la hexoquinasa18. Es el producto final de la glucólisis, que le da al yogur un aroma a ácido acético y un agradable sabor agrio. Este estudio encontró un aumento significativo en el piruvato de 0 a 36 h, acompañado por el rápido crecimiento de probióticos durante esta etapa de fermentación. Es probable que el rápido crecimiento de las bacterias se deba al ambiente inicialmente rico en glucosa y a un anabolismo de piruvato más alto que al catabolismo. A medida que termina la fermentación, la glucosa se agota y más piruvato se convierte en otros metabolitos posteriores, lo que ralentiza el crecimiento bacteriano. El piruvato también es un precursor de la acetil-CoA, un sustrato importante del ciclo TCA15. El ácido succínico y el ácido fumárico son productos intermedios del ciclo TCA. El ácido succínico, con su sabor agrio, salado y amargo, es una de las moléculas de señalización mitocondrial que regula el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias en las células19. El ácido fumárico es el ácido dicarboxílico insaturado más simple de la naturaleza con un sabor agrio afrutado20. El ácido succínico se puede oxidar a ácido fumárico por la succinato deshidrogenasa19. Similar al piruvato, este estudio encontró un aumento significativo en el ácido succínico a las 36 h. Sin embargo, el contenido de ácido fumárico continuó disminuyendo y no aumentó con la acumulación de ácido succínico. Esto puede implicar que las bacterias probióticas consumieron ácido fumárico. Algunas bacterias del ácido láctico (como Limosilactobacillus reuteri y Lacticaseibacillus casei) pueden utilizar el ciclo TCA en la dirección de la reacción de reducción, es decir, reducir el ácido fumárico para formar ácido succínico para promover el crecimiento bacteriano21. Además, el fumarato no se acumula en exceso durante el metabolismo normal y es rápidamente catalizado por la fumarato hidratasa para generar malato22. De hecho, detectamos ácido D-málico como un metabolito diferencial, aunque no aumentó significativamente a las 36 h en comparación con las 0 h. Esta puede ser otra razón de la disminución continua del ácido fumárico.

El metabolismo de los aminoácidos está estrechamente relacionado con el ciclo TCA, y los aminoácidos también son productos importantes del metabolismo de las fuentes de nitrógeno. El l-glutamato y el α-cetoglutarato conectan el metabolismo de los aminoácidos y el ciclo del TCA a través de la ruta metabólica del GABA23. La vía metabólica del GABA es una rama derivada del ciclo TCA, que es un proceso en el que los microorganismos descarboxilan directa e irreversiblemente el l-glutamato a través de la glutamato descarboxilasa para sintetizar GABA24. GABA es un aminoácido no proteico de cuatro carbonos, que tiene varias funciones, como bajar la presión arterial, efecto anticonvulsivo, calmar los nervios, mejorar el hígado y los riñones, fortalecer la capacidad antioxidante del cuerpo, aumentar la tolerancia al ejercicio, mejorar la función inmunológica y la capacidad reproductiva25 . Una vía fermentativa es la conversión microbiana de glutamato a GABA, que se desencadena por la disminución del pH durante la fermentación26. Nuestros resultados mostraron un aumento continuo en el contenido de GABA, que alcanzó su punto máximo al final de la fermentación, en correlación con la acidificación de la leche fermentada. Al mismo tiempo, GABA también es un factor de crecimiento para algunas bacterias, que se ha informado que promueve el crecimiento de probióticos en algunos sistemas de fermentación24. Esto está en línea con la observación actual de un crecimiento bacteriano activo con una alta viabilidad de los probióticos. Por otro lado, el glutamato imparte un sabor salado a altas concentraciones27, y su conversión a GABA a través de la fermentación mejora la calidad sensorial de la leche fermentada probiótica.

Los ácidos grasos generalmente se producen mediante procesos químicos como la lipólisis, la hidrólisis de proteínas y la fermentación de lactosa; y el metabolismo de los ácidos grasos se vincula con el ciclo del TCA a través del sustrato, acetil-CoA11. Los ácidos grasos no solo mejoran el sabor, el sabor y la textura del producto, sino que también tienen un impacto fisiológico en los consumidores. El principal ácido graso insaturado es el ácido oleico, que representa el 70% del total de ácidos grasos insaturados de la leche fermentada28. El ácido oleico puede regular los lípidos en la sangre, reducir el colesterol y mejorar la sensibilidad a la insulina; también puede reducir el estrés oxidativo y las respuestas inflamatorias excesivas en pacientes críticos29. Varios estudios detectaron disminuciones en el ácido oleico en productos lácteos durante la fermentación11,30, lo cual es consistente con nuestros resultados. Nuestro estudio encontró que el contenido de ácido oleico disminuyó significativamente después de 36 h de fermentación, lo que puede explicarse por la conversión de ácido oleico a ácido esteárico a través de la hidrogenación11. De hecho, observamos un aumento del ácido esteárico a las 36 h. Estudios epidemiológicos han encontrado que ingerir varios ácidos grasos tiene diferentes consecuencias biológicas31. Los niveles elevados de ácido esteárico se han asociado con la disminución de la presión arterial, la mejora de la función cardíaca y la reducción del riesgo de cáncer32. Contrariamente a la creencia popular de que los ácidos grasos saturados son dañinos, el ácido esteárico parece tener algunos efectos beneficiosos para la salud humana, aunque el mecanismo molecular de este fenómeno aún no está claro31,33. Otro ácido graso común detectado en la leche fermentada es el ácido palmítico, que generalmente se considera poco saludable34. Sin embargo, la mayoría de los estudios solo analizaron el efecto de una dosis alta de ácido palmítico32,35, y solo un estudio demostró los efectos apoptóticos y anticancerígenos deseables del ácido palmítico en la leche fermentada probiótica36. Aunque los productos lácteos son una importante fuente dietética de ácidos palmítico y esteárico, su ingesta se ha asociado con un menor riesgo de enfermedad cardiometabólica37. Por lo tanto, los aumentos en los ácidos palmítico y esteárico a través de la fermentación de la leche podrían ser deseables, pero se necesitarán más estudios para confirmar los efectos en la salud de estos metabolitos. Nuestros resultados mostraron que el nivel de ácido cáprico aumentó notablemente a las 36 h de fermentación y se mantuvo en un nivel alto hasta el final de la fermentación. El ácido cáprico es un ácido graso de cadena media que se encuentra en algunas leches fermentadas y que mejora la epilepsia, aumenta el metabolismo energético del cerebro y alivia el síndrome de malabsorción de nutrientes38.

En conclusión, este estudio generó instantáneas de la viabilidad bacteriana y los metabolomas de la leche fermentada con probióticos en diferentes momentos durante y después de la fermentación de la leche utilizando UPLC-QE-MS. El metaboloma de la leche fermentada probiótica cambió mucho en puntos de tiempo anteriores (entre 0 y 36 h), y mostró solo diferencias leves durante el período intermedio (entre 36 y 60 h) y maduración (entre 60 y 72 h). Se identificaron varios metabolitos diferenciales entre las diferentes etapas de la fermentación de la leche probiótica, incluidos principalmente ácidos orgánicos, aminoácidos y ácidos grasos, que participan en el ciclo TCA, el metabolismo del glutamato y el metabolismo de los ácidos grasos. Se identificaron nueve metabolitos diferenciales como biomarcadores diferenciales específicos de puntos temporales, y sus cambios pueden conducir a la calidad sensorial y nutricional única de la leche fermentada probiótica. Algunas biomoléculas funcionales, por ejemplo, piruvato, GABA y ácido cáprico, aumentaron significativamente al final de la fermentación, lo que podría contribuir a las propiedades beneficiosas de la leche fermentada probiótica. Este estudio de metabolómica a lo largo del tiempo analizó los cambios fermentativos específicos de los probióticos en la leche, proporcionando información detallada del metabolismo de los probióticos en una matriz de leche.

Se disolvió leche descremada en polvo (NZMP, Wellington, Nueva Zelanda) con glucosa al 2 % en agua destilada (50 °C, 30 min). La leche se homogeneizó (65 °C, 20 MPa) y se pasteurizó (95 °C, 5 min) antes de enfriarla a 20 °C. Las cepas bacterianas, B8589 y PC-01, se utilizaron para fermentaciones complejas. Ambas cepas eran probióticos proporcionados por la Colección de Cultivos de Bacterias del Ácido Láctico, Universidad Agrícola de Mongolia Interior, China. Los probióticos se inocularon en leche descremada pasteurizada enfriada y sus recuentos viables iniciales se ajustaron a 1 × 107 CFU/mL para PC-01 y 1 × 106 CFU/mL para B8589, respectivamente. La leche inoculada se fermentó anaerobiamente a 37 °C hasta que el pH alcanzó 3,8 después de 72 h. Después de alcanzar un pH de 3,8, la leche fermentada probiótica se almacenó a -80 °C hasta su posterior análisis. Se recolectaron muestras de leche fermentada cada 12 h durante el proceso de fermentación. El diseño del estudio se ilustra en la figura 1.

El conteo viable de bacterias probióticas en la leche fermentada se enumeró como se describió previamente39. Dos colorantes, SYTO 9 (5 mM) y yoduro de propidio (PI; 1 mg/ml), se disolvieron respectivamente en DMSO (≤1%). Las muestras de leche fermentada se diluyeron a una densidad de 106 a 107 CFU/mL, y 980 μL de muestras de leche fermentada diluida se transfirieron a cuatro tubos limpios. En tres de los tubos, 10 μL de PI (0,2 mM/L; tinción única de PI), 10 μL de SYTO 9 (0,1 mM/L; tinción única de SYTO 9) y 10 μL de tinción mixta (SYTO 9, 0,1 mM/L ; PI 0,2 mM/L; doble tinción), respectivamente. Los cuatro tubos de centrífuga se agitaron durante 30 sy se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Se mezclaron alícuotas de muestras doblemente teñidas (200 μL cada una) con una cantidad igual de microesferas de recuento absoluto (Flow Counting Fluorescent Spheres; Beckman Coulter Inc., Brea, CA, EE. UU.) para su análisis en un citómetro de flujo (MoFlo Astrios EQ Cell Sorter ; Beckman Coulter Inc., Brea, CA, EE. UU.).

La fuente de luz del citómetro de flujo era un láser de iones de argón enfriado por aire (longitud de onda de la luz de excitación a 488 nm; longitud de onda de la luz de emisión >630 nm). Para cada muestra, se recogieron datos de 500.000 células. Se usaron muestras no teñidas y muestras bacterianas teñidas con fluorescencia PI como controles. Se dibujaron diagramas de puntos de dispersión del lado de dispersión frontal y se configuró la puerta R1 para delinear las celdas objetivo. Se estableció un diagrama de dispersión con 488-513/26-Height-Log como abscisas y 561-614/20-Height-Log como ordenadas para delimitar el número de bacterias positivas para SYTO 9 y negativas para PI. Se estableció un gráfico de dispersión con 488-710/45-Height-Log como coordenada horizontal y 488-SSC-Area como coordenada vertical para enumerar microesferas de recuento absoluto. Recuento bacteriano total = recuento bacteriano viable/recuento absoluto de microesferas × recuento absoluto de concentración de microesferas × relación de dilución.

Las muestras (100 μL cada una) se mezclaron con 400 μL de solución de extracción (acetonitrilo:metanol = 1:1, que contenía una mezcla de patrón interno marcado isotópicamente) durante 30 s en tubos Eppendorf. Las mezclas se sonicaron durante 10 min en agua helada, se dejaron reposar a -4 °C durante 1 h y se centrifugaron a 4 °C, 12 000 rpm (fuerza centrífuga 13 800 × g, radio 8,6 cm) durante 15 min. Los sobrenadantes de las muestras se filtraron y transfirieron a viales de muestra limpios para análisis por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) con un Acquity UPLC (Vanquish, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.) acoplado a Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole- Espectrómetro de masas Orbitrap (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizó una columna Acquity UPLC BEH Amide (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) para la separación de analitos (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.). Se mezcló una cantidad igual de todas las muestras para componer la muestra de control de calidad que se analizará para garantizar la estabilidad de las condiciones instrumentales y cromatográficas. Las fases de cromatografía líquida fueron: una fase acuosa A, que contenía 25 mmol/L de acetato amónico y 25 mmol/L de agua amoniacal; la fase B era acetonitrilo. El gradiente de elución se programó de la siguiente manera: 0-0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, 95–65 % B; 7–8 min, 65–40 % B; 8–9 min, 40% B; 9–9,1 min, 40–95 % B; 9,1–12 min, 95 % B. La temperatura del plato de la muestra fue de 4 °C y el volumen de inyección fue de 2 μL. El espectrómetro de masas QE HFX se utilizó por su capacidad para adquirir espectros MS/MS en el modo de adquisición dependiente de la información (IDA) en el control del software de adquisición (Xcalibur, Thermo). En este modo, el software de adquisición evalúa continuamente el espectro de MS de barrido completo. Las condiciones de la fuente de ionización por electropulverización se establecieron como sigue: caudal de gas envolvente de 3,35 l/min; caudal de gas auxiliar de 16,8 L/min; la temperatura capilar de 350 °C; rango de masa de 70–1050; Tiempo de ciclo/escaneo de 760 ms; resolución MS completa de 60.000; resolución MS/MS de 7500; energía de colisión de 30/10/60 en modo de energía de colisión normalizada; voltaje de pulverización de 3,6 kV (modo de iones positivos) o 3,2 kV (modo de iones negativos), respectivamente.

El archivo de datos original fue convertido por el software ProteoWizard al formato mzXML. Se usó un paquete R autoescrito (kernel XCMS) para procesar datos para la identificación, extracción, alineación e integración de picos, y se usó una base de datos MS2 interna (BiotreeDB) para la anotación de metabolitos.

Las diferencias en los recuentos microbianos viables entre puntos de tiempo se evaluaron mediante ANOVA al nivel de significancia del 95 % (P < 0,05) mediante el uso de R versión 4.0.4 (R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria). Los cambios metabolómicos entre los puntos de tiempo se visualizaron mediante el análisis de componentes principales y OPLS-DA, que se construyeron con la herramienta en línea Metaboanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca). Los metabolitos detectados se visualizaron mediante gráficos de volcanes y se seleccionaron características metabólicas significativamente diferenciales según el cambio de pliegue (cambio de pliegue > 2 o < 0,5) y el valor P (P < 0,05). La anotación de rutas metabólicas y el análisis de enriquecimiento de metabolitos diferenciales se realizaron utilizando la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html). Se construyó un diagrama esquemático del diseño del estudio mediante la herramienta en línea BioRender (https://app.biorender.com/).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Declaramos que todos los datos relacionados con este estudio están incluidos en este documento y su información complementaria.

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Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32260572), los Proyectos Principales de Ciencia y Tecnología de Mongolia Interior (2021ZD0014), el fondo destinado a CARS-36 y el Proyecto Principal en la Fundación de Ciencias Naturales de la Región Autónoma de Mongolia Interior ( n.º 2020ZD12).

Estos autores contribuyeron igualmente: Yaru Sun, Shuai Guo.

Laboratorio clave de biotecnología e ingeniería láctea (Universidad Agrícola de Mongolia Interior), Ministerio de Educación, 010018, Hohhot, China

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang y Jicheng Wang

Laboratorio Clave de Procesamiento de Productos Lácteos, Ministerio de Agricultura y Asuntos Rurales, 010018, Hohhot, China

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang y Jicheng Wang

Laboratorio clave de biotecnología e ingeniería láctea de Mongolia Interior, Universidad Agrícola de Mongolia Interior, 010018, Hohhot, China

Yaru Sun, Shuai Guo, Ting Wu, Jingwen Zhang, Lai-Yu Kwok, Zhihong Sun, Heping Zhang y Jicheng Wang

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Correspondencia a Jicheng Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Sun, Y., Guo, S., Wu, T. et al. El enfoque de metabolómica basado en espectrometría de masas no dirigida revela cambios bioquímicos en la leche fermentada probiótica compuesta durante la fermentación. npj Sci Food 7, 21 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

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Recibido: 09 Diciembre 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 24 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00197-z

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